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BON COURGE

BIOCHIMIE METABOLIQUE : ENZYMOLOGIE

Exercice 1

La lactase hydrolyse le lactose en glucose et galactose. On détermine la vitesse d’hydrolyse du lactose par la lactase (β-galactosidase) (E.C. 3.2.1.23) dans les conditions initiales. Il  apparaît 0,672x10^-2 moles de glucose en 10minutes. On a introduit dans le milieu 1mL de solution enzymatique dont la teneur en protéines est de 2,85 g.L^-1.

a)  Ecrire l’équation de la réaction

b)  Que signifie le terme « conditions initiales », Préciser les conditions de concentrations en substrat.

c)  Calculer la concentration d’activité catalytique de la préparation en enzymatique en UI/mL.

d)  Calculer l’activité spécifique de l’enzyme en UI.mg^-1

e)  Calculer l’activité molaire spécifique en considérant que l’on est en présence d’une enzyme pure.(PM = 135000 Da).

Exercice 2

Une enzyme E est constitué de 2 sous-unités identiques de poids moléculaires voisins de 50000 Da. La réaction catalysée est :

S                          E                          P

On dispose d'un extrait de E contenant 3 mg de protéines par mL et dans lequel I'enzyme est pure à 80%. La détermination d'activité est réalisée par spectrophotométrie à 512 nm, longueur d'onde à laquelle le produit P absorbe mais non  le substrat S. Le coefficient d'absorption molaire du produit est égal dans les conditions de la mesure à5 000 mol^-1.L.cm^-1. La cuve utilisée a une largeur de 1 cm.

Le milieu réactionnel, tamponné à pH 7 et thermostaté à 30 °C, contient une concentration saturante en substrat. Son volume est de 3 mL. On utilise pour la détermination100 µL d'extrait de E diluée au 500^ème. On arrête la réaction en ajoutant 2 ml de réactif d'arrêt au milieu réactionnel après 2 minutes de temps de réaction. La variation d'absorbance lue est égale à 0,6 unité d'absorbance.

Calculer la concentration d'activité catalytique dans l'extrait E et l'activité spécifique. En déduire le Turn Over Number à 30 °C et pH7.

Exercice 3

On réalise sur une préparation pure en enzyme la mesure de l'apparition du produit en fonction du temps pour une concentration en substrat de 0,1mol.L^-1dont voici les résultats.

1.  Tracer le graphique de la concentration de produit en fonction du temps.

2.  Déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique

On mesure la vitesse initiale pour différentes concentrations de substrat.

3.  Donner la signification de Vmax et Km.

4.  Déterminer graphiquement les constantes cinétiques de cette enzyme.

Exercice 4

 Caractéristiques de la réaction enzymatique.

1. Donner la définition d'une enzyme. Préciser sa nature chimique et sa structure.
2. Ecrire le mécanisme général d'une réaction catalysée par une enzyme, en précisant la signification des symboles utilisés et en notant les constantes des vitesses des réactions mises en jeu.
3. La cinétique d'une réaction enzymatique est définie par deux paramètres : KM et VM. Donner leurs significations respectives et écrire l'expression de KM en fonction des constantes de vitesse évoquées en 2.
4. Citer trois facteurs importants susceptibles de modifier l'action d'une enzyme. Etudier plus particulièrement l'influence de l'un de ces facteurs.
5.  On étudie l'influence de la concentration en substrat sur la cinétique d'une réaction enzymatique.

-      l'une mettant en présence l'enzyme et son substrat ;

-      l'autre en présence d'un inhibiteur de l'enzyme.

On obtient les résultats regroupés dans le tableau suivant :

Les valeurs de vi sont exprimées en moles de substrat transformé par minutes.

1. Déterminer les valeurs de m et Km en présence et en absence de l’inhibiteur.
2. Quelle est le type d’inhibition exercé par l’inhibiteur ?

Exercice 5

1. Que devient la valeur v/m quand [S] = 4Km ?
2. Si Vm = 100 µmol/ml/s et Km = 2 mM, quelle est la vitesse de la réaction quand [S] = 20 mM ?
3. Dans une réaction à cinétique de type Michaelis-Menten, K₁ = 7 x 10^-7M^-1s^-1, K_-1 = 1 x 10³s^-1, et k₂ = 2 x 10⁴ s^-1. Quelle sont les valeurs de Kd et Km ? La fixation du substrat atteint-elle l’équilibre ou plutôt de l’état stationnaire ?
4. Les résultats suivants sont obtenus au cours d’une réaction enzymatique, (1) en présence d’un inhibiteur, (2) et (3) en présence de deux inhibteurs diffrents à la concentration 5 mM. [Et] est le même dans chaque expérience.

 a. Déterminez Vm et Km de l’enzyme.

b. Déterminez le type d’inhibition et le Ki pour chaque inhibiteur.

Exercice 6

Nous avons la réaction chimique suivante :

Les concentrations initiales de A et B sont 0,01 mole/l. Les quantités de D dérivés de A formées au cours du temps sont :

1. Montrer que la réaction est d'ordre global 2.
2. Calculer la constante de vitesse ainsi que t1/2  .

Exercice 7

La D-glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase de muscle de lapin est un tétramère de poids moléculaire 136000, constitué de quatre sous-unités identiques portant chacun un site actif. L'enzyme catalyse la réaction suivante :

Les vitesses initiales (exprimées en variation d'absorbance par minutes, ∆A340 min-1) obtenues pour différentes concentrations de NAD+ et mesurées par l'apparition de NADH à 340 nm (ε = 6220 M-1cm-1) sont présentés en absence (vo) et en présence (v'o) de 10-8 M d'inhibiteur qui est l'acide iodoacétique.

1. Déterminer les paramètres cinétiques de l'enzyme.
2. Quelles conclusions tirez-vous de l'expérience avec l'acide iodoacétique, sachant que la concentration de l'enzyme dans les 2 expériences, exprimée en tétramère, est de 5 x 10-9 M ?

Exercice 8

L'activité d'une enzyme est mesurée en fonction de la concentration en substrat en absence et en présence d'inhibiteur (2 x 10-3 M). On trouve les résultats suivants :

1. Déterminer VM et KM en absence et en présence d'inhibiteur.
2. Quel est le type d'inhibition, calculer le KI.
3. Si [S] = 1 x 10-5 M et [I] = 2 x 10-3 M, quel pourcentage des molécules d'enzyme est lié au substrat, à l'inhibiteur ?

Comparez votre résultat au rapport des vitesses.

Exercice 9

L'activité de la malonyl transamylase est inhibée par l'acétyl-coenzyme A. Le tableau donne les vitesses de la réaction (exprimées en unités arbitraires) à différentes concentrations de malonyl-coenzyme A, en présence ou en absence d'acétyl-Coenzyme A.

Déterminer le type d'inhibition et le KI correspondant.

Exercice 10

'acide 1-anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) est un inhibiteur de l'acétylcholine estérase. Pour déterminer la nature de l'inhibition, on a mesuré les vitesses initiales d'hydrolyse de l'acétylcholine, à différentes concentrations de ce substrat, en absence d'ANS (expérience A), en présence d'ANS (2,05 x 10-4 M) (expérience B) et 1,07 x 10-4 M d'ANS (expérience C). Le tableau suivant exprime ces expériences. Les vitesses sont exprimées en µM d'acétylcholine hydrolysé par minute et par mg de protéine.

Quel est le type d'inhibition et le KI correspondant ?

Exercice 11

La décomposition enzymatique de A est inhibée par B ou C. D'après le tableau suivant, calculer KMet Vmax et en déduire le type d'inhibition pour chacun des inhibiteurs.